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?? 利用Fmoc固相合成策略, Wang樹脂為載體, 合成了3條[4 Trt+2 Acm]保護的利那洛肽線性前體化合物(圖 1).

圖1 三條[4 Trt+2 Acm]保護的利那洛肽線性前體化合物 Figure1. Three linear precursors of linaclotide containing [4 Trt+2 Acm] groups

1.1.1?? 一步氧化形成兩對二硫鍵

將多肽樹脂放入反應瓶中裂解, 乙醚沉淀得到粗肽, 粗肽分離純化后進行質(zhì)譜檢測, a ([M+H]⁺＝1674.8, [M+Na]⁺＝1696.8, [M+K]⁺＝1712.8), b ([M+H]⁺＝1674.9, [M+Na]⁺＝1696.9, [M+K]⁺＝1712.9), c ([M+H]⁺＝1674.7, [M+Na]⁺＝1696.7, [M+K]⁺＝1712.7), 利那洛肽[4 SH+2 Acm]的線性前體肽理論分子量為1673.5, 證明得到的多肽結(jié)構為[4 SH+2 Acm].使用氯化血紅素催化氧化的方法分別氧化a、b、c, 其中a、b氧化可以得到一個主產(chǎn)物a-1、b-1, 由于c的氧化產(chǎn)物過于復雜(圖 2), 沒有對其分離及進行下一步反應.分別對a-1、b-1進行分離純化, 質(zhì)譜檢測a-1 ([M+Na]⁺＝1692.4, [M+K]⁺＝1708.4), b-1 ([M+ H]⁺＝1670.5, [M+Na]⁺＝1692.5, [M+K]⁺＝1708.4), 證明其結(jié)構為[2 S-S+2 Acm].

圖2 三條[4 Trt+2 Acm]利那洛肽的線性前體肽脫除Trt保護后一步氧化形成兩對二硫鍵HPLC分析 Figure2. After removing Trt from [4 Trt+2 Acm] linear precursors of three linaclotides were oxidized to form two disulfide bonds (A) a [4 SH(2, 5, 10, 13)+2 Acm(1, 6)], (B) b [4 SH(1, 5, 6, 13)+2 Acm(2, 10)], (C) c [4 SH(1, 2, 5, 10)+2 Acm(5, 13)]

1.1.2?? 氧化形成第三對二硫鍵

在下一步脫除Acm保護基形成二硫鍵的反應中, 我們首先嘗試了I₂氧化脫除的方法, 但與文獻報道一樣, 都沒有得到目標產(chǎn)物.如前體肽a-1 [2 S-S(2-10, 5-13)+2 Acm(1, 6)], 只含有一對Acm保護基, 理論上脫Acm后HPLC分析應該為一個單峰, 但滴加I₂氧化后卻生成了三個產(chǎn)物, 且都不是目標多肽.隨后我們采用了PhS(O)Ph/CH₃SiCl₃氧化的方法, 將上面得到的a-1溶于TFA中, 加入過量的CH₃SiCl₃和PhS(O)Ph攪拌反應20 min, 加入乙醚和4 mol/L的醋酸震蕩, 取水相與a-1、利那洛肽標準品共同進樣HPLC分析.從色譜圖上看, a-1反應完全, 幾乎定量得到單一的產(chǎn)物a-2, a-2的色譜行為與標準品一致(圖 3).將a-2分離純化后進行質(zhì)譜檢測, a-2 ([M+H]⁺＝1526.6, [M+Na]⁺＝1548.6, [M+ K]⁺＝1564.6), 利那洛肽的理論分子量為1525.4, 與理論值相符, 可以證明a-2為利那洛肽, 同時也證明了a-1中的兩對二硫鍵連接方式為Cys2-Cys10, Cys5-Cys13.

圖3 a-1 [2 S-S(2-10, 5-13)+2 Acm(1, 6)]采用PhS(O)Ph/ CH₃SiCl₃體系氧化后HPLC分析(*為雜質(zhì)峰) Figure3. HPLC analysis of a-1 [2 S-S(2-10, 5-13)+2 Acm(1, 6)] after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH₃SiCl₃) (A) a-1 after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH₃SiCl₃), (B) mixture of A and a-1, (C) mixture of A and standard linaclotide (S). The peak * (retention time at 14.5 min) LCMS observed [M+H]⁺＝247

在其它條件不變情況下, 將a-1與PhS(O)Ph、CH₃SiCl₃反應的時間延長至30 min, HPLC分析結(jié)果相同, 說明反應沒有二硫鍵重排現(xiàn)象發(fā)生^[14], PhS(O)Ph/ CH₃SiCl₃氧化的方法可以用于脫除利那洛肽的線性前體肽中半胱氨酸的Acm保護基, 并氧化形成二硫鍵.

然而, 在使用相同的方法脫除b-1上半胱氨酸的Acm保護基時, HPLC分析發(fā)現(xiàn)b-1與PhS(O)Ph/ CH₃SiCl₃幾乎不反應, 我們在開始嘗試用I₂脫除b-1中的Acm保護基時也發(fā)現(xiàn)存在同樣的現(xiàn)象.說明b-1中的兩對二硫鍵形成的特定空間結(jié)構, 大大降低了Cys2和Cys10之間相互接觸發(fā)生反應的幾率, 使其不能順利脫除Acm保護基而形成二硫鍵.

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