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合成了3條[2 Trt+4 Acm]保護的利那洛肽線性前體化合物(圖 4).

圖4 三條[2 Trt+4 Acm]保護的利那洛肽線性前體化合物 Figure4. Three linear precursors of linaclotide containing [2 Trt+4 Acm] groups

圖5 三條[2 Trt+4 Acm]利那洛肽的線性前體肽脫除Trt保護后氧化形成第一對二硫鍵HPLC分析 Figure5. After removing Trt from [2 Trt+4 Acm] linear precursors of linaclotide, were oxidized to form one disulfide bond (A) d [2 SH(1, 6)+4 Acm(2, 5, 10, 13)], (B) e [2 SH(2, 10)+4 Acm(1, 5, 6, 13)], (C) f [2 SH(5, 13)+4 Acm(1, 2, 6, 10)]

1.2.1?? 氧化形成第一對二硫鍵

使用第1.1.1節中的相同方法裂解樹脂, 得到含自由巰基的利那洛肽線性前體肽d、e、f, 質譜檢測d ([M+H]⁺＝1816.9, [M+Na]⁺＝1839.0, [M+K]⁺＝1855.0), e ([M+Na]⁺＝1838.6, [M+K]⁺＝1854.6), f ([M+H]⁺＝1816.7, [M+Na]⁺＝1838.7, [M+K]⁺＝1854.7), 利那洛肽[2 SH+4 Acm]的線性前體肽理論分子量為1815.5, 證明制得的多肽結構為[2 SH+4 Acm].在下一步使用氯化血紅素催化氧化形成二硫鍵時, 由于d、e、f只含有一對自由的巰基, HPLC分析幾乎都得到了唯一的產物: d-1、e-1、f-1, 分別將其進行分離純化進行質譜分析, d-1 ([M+H]⁺＝1813.4, [M+Na]⁺＝1836.6, [M+K]⁺＝1852.5), e-1 ([M+H]⁺＝1814.7, [M+Na]⁺＝1836.6, [M+K]⁺＝1852.6), f-1 ([M+Na]⁺＝1836.7, [M+K]⁺＝1852.7), 證明其結構為[1 S-S+4 Acm].

1.2.2?? 一步氧化形成剩余兩對二硫鍵

使用(PhS(O)Ph)/(CH₃SiCl₃)方法一步氧化d-1、e-1、f-1, 加乙醚、醋酸震蕩后取水相進行HPLC分析, 發現d-1氧化得到兩個主產物d-2、d-3, 色譜峰面積比為57: 43(圖 6, A); e-1氧化產物復雜, 沒有明顯的主產物; f-1氧化得到一個主產物f-2(圖 7, A).

圖6 d-1 [1 S-S(1, 6)+4 Acm(2, 5, 10, 13)]采用(PhS(O)Ph)/ (CH₃SiCl₃)體系氧化后HPLC分析(*為雜質峰) Figure6. HPLC analysis of d-1 [2 S-S(1, 6)+4 Acm(2, 5, 10, 13)] after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH₃SiCl₃)(A) d-1 after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH₃SiCl₃), (B) mixture of A and d-1, (C) mixture of A and standard linaclotide(S). The peak* (retention time at 14.5 min) LCMS observed [M+H]⁺＝247

圖選項

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圖7 f-1 [1 S-S(5, 13)+4 Acm(1, 2, 6, 10)]采用PhS(O)Ph/ CH₃SiCl₃體系一步氧化后HPLC分析(*為雜質峰) Figure7. HPLC analysis of (A) f-1 [1 S-S(5, 13)+4 Acm (1, 2, 6, 10)] after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH3SiCl3) f-1 after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH3SiCl3), (B) mixture of A and f-1, (C) mixture of A and standard linaclotide (S). The peak* (retention time at 14.5 min) LCMS observed [M+H]⁺＝247

將d-1氧化反應的水相與d-1、利那洛肽標準品共進樣HPLC分析, 發現d-3的色譜行為與標準品一致(圖 6, B、C), 將d-2, d-3分離純化后進行質譜檢測, d-2 ([M+H]⁺＝1526.5, [M+Na]⁺＝1548.6, [M+K]⁺＝1564.5), d-3 ([M+H]⁺＝1526.5, [M+Na]⁺＝1548.5, [M+K]⁺＝1564.4) 都與利那洛肽的理論分子量相符, 證明d-2為利那洛肽的二硫鍵錯配異構體, d-3為利那洛肽.

將f-1氧化反應的水相與f-1、利那洛肽標準品共同進樣HPLC分析, 發現f-2的色譜行為與標準品一致(圖 7, B、C), 將f-2分離純化后質譜檢測, f-2 ([M+H]⁺＝1526.5, [M+Na]⁺＝1548.5, [M+K]⁺＝1564.5) 與利那洛肽的理論分子量相符, 證明f-2為利那洛肽.