高效液相色譜（HPLC）是一種色譜分析技術，用來分離混合物，以確認并量化各個成分的比例。正因為HPLC在化學實驗室中應用非常普遍，大家難免遇到這樣那樣的問題，那么使用HPLC常見的問題有哪些呢？又怎么去解決呢？
作為一種高精密儀器，高效液相色譜儀在使用過程中的操作要注意很多細節，否則就容易出現一些問題。其中最常見的問題就是柱壓問題、漂移問題，和峰型異常的問題。
1. 柱壓問題
柱壓問題是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關。所謂柱壓穩定并不是指壓力值穩定于一個恒定值而是指壓力波動范圍在50PSI（3.3 Bar）之間（在使用梯度洗脫時，柱壓平穩緩慢的變化是允許的）。壓力過高、過低都屬于柱壓問題。
– 壓力過高
這是高效液相在使用中最常見的問題，指的是壓力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時，我們應該分段進行檢查。 (1)首先斷開真空泵的入口處，此時PEEK管里充滿液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體自由滴下，則溶劑過濾頭正常。 如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡半個小時，再用超純水沖洗干凈。 (2)打開Purge閥，使流動相不經過柱子，如果壓力降至100PSI (6.7 Bar)以下，則過濾白頭正常。 如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。處理方法：將過濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個小時。 (3)把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強保留的物質導致堵塞，則要用比現在流動相更強的流動相沖至壓力正常。假如按上面的方法長時間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進出口反過來接在儀器上，用流動相沖洗柱子。這時，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。
– 壓力過低
壓力過低的現象一般是由于系統泄漏，處理方法：尋找各個接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。當然還有一個原因就是泵里進了空氣，但此時表現的往往是壓力不穩，忽高忽低，更嚴重一點會導致泵無法吸上液體。處理方法：打開Purge閥，用3~5ml/min的流速沖洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。
2. 漂移問題
主要包括基線漂移和保留時間漂移。
– 基線漂移
一般說來，機器剛起動時，基線容易漂移，大概要半個小時的平衡時間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長下（220nm）平衡時間相對會比較長，但如果你在實驗過程中發現基線漂移，則你要考慮下面的原因：
（1）柱溫波動。即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。 解決方法：控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器，檢查是否有打開的窗戶或空調對著柱溫箱。
（2）流通池被污染或有氣體。 解決方法：用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池（最好斷開柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）。
（3）紫外燈能量不足。解決方法：更換新的紫外燈
（4）流動相污染、變質或由低品質溶劑配成。解決方法：檢查流動相的組成，使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑。
（5）樣品中有強保留的物質（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現出一個逐步升高的基線。解決方法：使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子。
（6）檢測器沒有設定在最大吸收波長處。解決方法：將波長調整至最大吸收波長處。
（7）流動相的PH值沒有調節好。解決方法：加適量的酸或堿調至最佳PH值
（8）使用循環溶劑，但檢測器未調整。解決辦法：重新設定基線。當檢測器動力學范圍發生變化時，使用新的流動相。
（9）柱平衡慢，特別是流動相發生變化時。解決辦法：用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。
（10）流動相配比不當或流速變化。解決辦法：更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。
（11）檢測器出口阻塞（高壓造成流通池窗口破裂，產生噪音基線）。解決辦法：取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。
（12）流動相不均勻（流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導致的漂移）。解決辦法：使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中使用氦氣。
– 保留時間漂移
保留時間重現是液相性能好壞的一個重要標志，同一種東西，兩次的保留時間相差不要超過15s，超過了半分鐘可看做保留時間漂移，就無法進行定性，你要考慮以下原因：
（1）溫控不當。解決方法：調好柱溫，檢查是否有打開的窗戶或空調對著柱溫箱。
（2）流動相比例變化。解決方法：檢查四元泵的比例閥是否有故障。
（3）色譜柱沒有平衡。解決方法：在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱 。
（4）流速變化。解決方法：重新設定流速。
（5）泵中有氣泡。解決方法：從泵中除去氣泡 。
3. 峰型異常問題
峰型問題是液相的主要問題，在做液相過程中，我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型，對于各種各樣的異常峰，要區別對待，從主要問題出發，逐個加以解決。針對各種情況的成因作相應調整即可。 （1）色譜圖中未出峰。原因：系統未進樣或樣品分解；泵未輸液或流動相使用不正確；檢測器設置不正確。
（2）一個峰或幾個峰是負峰。原因：流動相吸收本底高；進樣過程中進入空氣；樣品組分的吸收低于流動相。
（3）所有峰均為負峰。原因：信號電纜接反或檢測器輸出極性設置顛倒；光學裝置尚未達到平衡。
（4）所有峰均為寬峰。原因：系統未達到平衡；溶解樣品的溶劑極性比流動相差很多；色譜柱尺寸及類型選擇不正確；色譜柱或保護柱被污染或柱效降低；溫度變化造成的影響；流動相組成變化；流動相粘度過高流速太低；樣品體積過大；檢測器時間常數過大；檢測池體積過大；保留時間太長；柱外體積過大；樣品過載等。
（5）所出峰比預想的小。原因：樣品黏度過大；進樣品故障或進樣體積誤差；檢測器設置不正確．定量環體積不正確；檢測池污染；檢測器燈出現問題。
（6）出現雙峰或肩峰。原因：進樣量過大；樣品濃度過高；保護柱或色譜柱柱頭堵塞；保護拄或色譜柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
（7）前伸峰。原因：進樣量或樣品濃度高；溶解樣品的溶劑較流動相極性強；保護柱或色譜柱污染或失效。
（8）拖尾峰。原因及解決辦法：柱超載，降低樣品量或增加柱直徑采用較高容量的固定相；峰干擾，對樣品進行清潔過濾或調整流動相；硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度，降低流動相pH值；柱內燒結不銹鋼失效，更換燒結不銹鋼，加在線過濾器，對樣品進行過濾；死體積或柱外體積過大，將連接點降至最低, 盡可能使用內徑較細的連接管；柱效下降，更換柱子, 采用保護柱，對柱子進行再生。
（9）出現平頭峰。原因：檢測器設置不正確；進樣體積太大或樣品濃度太高。
（10）出現鬼峰。原因及解決辦法：進樣閥殘余峰，在每次進完樣后用充足的時間來平衡和清洗系統；樣品中存在未知物，改進樣品的預處理；流動相污染，更換新流動相，盡可能現配現用，隔夜的流動相再次使用時要過濾；盡可能使用HPLC級試劑；流路中有小的氣泡，打開Purge閥，加大流速排除。
另外，還有一些用戶的經驗總結如下：
色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。
1、樣品的前處理：
– 最好使用流動相溶解樣品。
– 使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。
– 使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。
2、流動相的配制： 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
– 流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。 – 流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應(特殊情況除外)。
– 流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果;同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
– 流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
– 流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。
– 在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。
3、流動相流速的選擇： 因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。 當選用最佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。
