分享一篇發表在ACS Chem. Biol.上的文章，題目為“Chemoproteomic Profiling of Clickable Fumarate Probes for Target Identification and Mechanism of Action Studies”，通訊作者是來自美國Biogen公司的Douglas S. Johnson和Lu Zhang。這篇文章中作者設計了一種可點擊探針用于富馬酸酯的靶標鑒定和作用機制研究。
富馬酸二甲酯（DMF）是針對多發性硬化癥的一種成熟口服療法，然而DMF具有廣譜的體內反應性和復雜的藥代動力學，其作用機制仍不清楚。DMF在生理條件下容易水解產生富馬酸單甲酯（MMF），這兩種富馬酸酯會在蛋白質上的半胱氨酸殘基上形成共價修飾，發揮調控功能。因此對DMF和MMF進行蛋白質組水平的靶標鑒定有助于明確DMF的治療機制。
于是作者在DMF和MMF的結構中引入生物正交的炔基基團，合成了兩種富馬酸酯的可點擊類似物探針DMF-yne和MMF-yne。使用探針對活細胞或細胞裂解液進行標記后，通過膠內熒光觀察探針標記的蛋白質。結果顯示兩種探針都可以濃度依賴地標記蛋白質，并且這種標記可以被各自的母體化合物DMF和MMF所競爭。作者進一步將探針標記的蛋白與生物素偶聯后使用鏈霉親和素進行富集，利用Western Blot驗證了探針可以對富馬酸酯的已知靶標KEAP1進行共價修飾。
在驗證了探針與母體化合物富馬酸酯具有相似的反應性后，作者采用定量蛋白質組學方法對富馬酸酯靶標進行全面分析。利用TMT-16plex，作者整合了探針濃度梯度和母體化合物競爭濃度梯度實驗，獲得了DMF_yne和MMF_yne探針特異性標記的定量靶標譜圖。隨后，作者通過Western Blot對質譜結果中兩種探針的的共同靶標如GAPDH和DJ-1，以及兩種探針的獨特靶標如ALDH2和VDAC3等蛋白與探針的共價反應進行了驗證。
最后，作者利用基于碘乙酰胺-脫硫生物素探針的TMT-ABPP實驗，對細胞中DMF和MMF的半胱氨酸反應性進行了分析，鑒定富馬酸酯敏感的半胱氨酸位點。將結果與基于富馬酸酯探針的定量化學蛋白質組學結果進行比較，作者發現兩種方法都能鑒定到很多獨特的靶標，說明其開發的富馬酸酯探針可以作為鑒定富馬酸酯敏感靶標的很好的補充方法。
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總之，這篇文章中作者設計了一種可點擊的富馬酸酯探針，用于鑒定富馬酸酯藥物的共價修飾靶標。
本文作者：LCX
責任編輯：LZ
DOI：10.1021/acschembio.4c00617
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acschembio.4c00617
