分享一篇發(fā)表在RSC Chemical Biology上的文章，題目為“Functionalization of a versatile fluorescent sensor for detecting protease activity and temporally gated opioid sensing”，通訊作者是來自密歇根大學(xué)安娜堡分校的Wenjing Wang教授，研究方向是基于蛋白質(zhì)的新型傳感器。
遺傳編碼的熒光傳感器被廣泛應(yīng)用于檢測細(xì)胞信號分子和事件。這些傳感器具有不同的信號讀出方式，用于檢測GPCR等受體或蛋白酶的活性，可被分為多組分系統(tǒng)和單組分系統(tǒng)。在單組分系統(tǒng)中，SPOTIT（Single-chain Protein-based Opioid Transmission Indicator Tool）系列具有多功能性和巨大的功能潛力，然而其對于蛋白酶的響應(yīng)還尚未實(shí)現(xiàn)功能化，并且缺少時(shí)間門控的控制方式。因此，在本文中作者以cpGFP-Nb39為基礎(chǔ)發(fā)展了一種新型的熒光傳感器 MAturation-based Protease-gated Indicator Tool (MAPIT)，用于檢測病毒蛋白酶，并實(shí)現(xiàn)了基于小分子的時(shí)間門控。
MAPIT包含兩個(gè)Nb39 nanobody，當(dāng)阿片類藥物存在時(shí)，一個(gè)Nb39會與受體MOR相互作用，然而另一個(gè)Nb39仍與cpGFP結(jié)合抑制其發(fā)光。當(dāng)?shù)鞍酌盖懈钍录l(fā)生時(shí)一個(gè)Nb39離去，與cpGFP結(jié)合的Nb39結(jié)合MOR會釋放出GFP從而產(chǎn)生熒光。
首先，由于增加linker的長度可以增加對蛋白酶的通用性，但linker的長度可能影響 Nb39 和 cpGFP 之間的相互作用。因此，作者在單組分系統(tǒng)中優(yōu)化了linker的長度。他們發(fā)現(xiàn)在兩側(cè)各15個(gè)氨基酸的情況下仍然能夠保持28的信噪比（SBR），并且在未切割的條件下不會影響對cpGFP發(fā)光的抑制。隨后作者針對新冠病毒的蛋白酶Mpro優(yōu)化了酶切位點(diǎn)的序列，其中VARLQ↓SGF 顯示出最佳的 Mpro 依賴性熒光激活。
?隨后，作者又進(jìn)一步在細(xì)胞體系下檢測了MAPIT的特異性，他們發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)表達(dá)?Mpro時(shí)熒光才會被激活，而當(dāng)表達(dá)TEVp或HCVp時(shí)均不會被激活，表明傳感器對蛋白酶底物的特異性。最后，作者進(jìn)一步引入了Tet-On系統(tǒng)，建立了Dox激活的Dox-MAPIT傳感器。作者在Dox?存在下對?Dox-MAPIT?進(jìn)行了芬太尼劑量反應(yīng)曲線，觀察到EC50為50 nM，比此前開發(fā)的時(shí)間門控SPOTIT系統(tǒng)有較大的靈敏度提升。
總的來說，作者開發(fā)了一種多功能熒光傳感器，用于檢測蛋白酶活性和時(shí)間門控的阿片類物質(zhì)感知。
本文作者：WYQ
責(zé)任編輯：MB
DOI：10.1039/d4cb00276h
原文鏈接：https://doi.org/10.1039/d4cb00276h
