高效液相色譜（HPLC）是一種色譜分析技術(shù)，用來分離混合物，以確認(rèn)并量化各個(gè)成分的比例。正因?yàn)镠PLC在化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用非常普遍，大家難免遇到這樣那樣的問題，那么使用HPLC常見的問題有哪些呢？又怎么去解決呢？
作為一種高精密儀器，高效液相色譜儀在使用過程中的操作要注意很多細(xì)節(jié)，否則就容易出現(xiàn)一些問題。其中最常見的問題就是柱壓問題、漂移問題，和峰型異常的問題。
1. 柱壓問題
柱壓問題是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個(gè)恒定值而是指壓力波動(dòng)范圍在50PSI（3.3 Bar）之間（在使用梯度洗脫時(shí)，柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的）。壓力過高、過低都屬于柱壓問題。
– 壓力過高
這是高效液相在使用中最常見的問題，指的是壓力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時(shí)，我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。 (1)首先斷開真空泵的入口處，此時(shí)PEEK管里充滿液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體自由滴下，則溶劑過濾頭正常。 如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡半個(gè)小時(shí)，再用超純水沖洗干凈。 (2)打開Purge閥，使流動(dòng)相不經(jīng)過柱子，如果壓力降至100PSI (6.7 Bar)以下，則過濾白頭正常。 如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。處理方法：將過濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個(gè)小時(shí)。 (3)把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞，則要用比現(xiàn)在流動(dòng)相更強(qiáng)的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長時(shí)間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。
– 壓力過低
壓力過低的現(xiàn)象一般是由于系統(tǒng)泄漏，處理方法：尋找各個(gè)接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。當(dāng)然還有一個(gè)原因就是泵里進(jìn)了空氣，但此時(shí)表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn)，忽高忽低，更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無法吸上液體。處理方法：打開Purge閥，用3~5ml/min的流速?zèng)_洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。
2. 漂移問題
主要包括基線漂移和保留時(shí)間漂移。
– 基線漂移
一般說來，機(jī)器剛起動(dòng)時(shí)，基線容易漂移，大概要半個(gè)小時(shí)的平衡時(shí)間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長下（220nm）平衡時(shí)間相對會(huì)比較長，但如果你在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：
（1）柱溫波動(dòng)。即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。 解決方法：控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱。
（2）流通池被污染或有氣體。 解決方法：用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池（最好斷開柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）。
（3）紫外燈能量不足。解決方法：更換新的紫外燈
（4）流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。解決方法：檢查流動(dòng)相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑。
（5）樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。解決方法：使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。
（6）檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處。解決方法：將波長調(diào)整至最大吸收波長處。
（7）流動(dòng)相的PH值沒有調(diào)節(jié)好。解決方法：加適量的酸或堿調(diào)至最佳PH值
（8）使用循環(huán)溶劑，但檢測器未調(diào)整。解決辦法：重新設(shè)定基線。當(dāng)檢測器動(dòng)力學(xué)范圍發(fā)生變化時(shí)，使用新的流動(dòng)相。
（9）柱平衡慢，特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)。解決辦法：用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10-20倍體積的新流動(dòng)相對柱子進(jìn)行沖洗。
（10）流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化。解決辦法：更改配比或流速。為避免這個(gè)問題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。
（11）檢測器出口阻塞（高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線）。解決辦法：取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。
（12）流動(dòng)相不均勻（流動(dòng)相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移）。解決辦法：使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用氦氣。
– 保留時(shí)間漂移
保留時(shí)間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個(gè)重要標(biāo)志，同一種東西，兩次的保留時(shí)間相差不要超過15s，超過了半分鐘可看做保留時(shí)間漂移，就無法進(jìn)行定性，你要考慮以下原因：
（1）溫控不當(dāng)。解決方法：調(diào)好柱溫，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱。
（2）流動(dòng)相比例變化。解決方法：檢查四元泵的比例閥是否有故障。
（3）色譜柱沒有平衡。解決方法：在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱 。
（4）流速變化。解決方法：重新設(shè)定流速。
（5）泵中有氣泡。解決方法：從泵中除去氣泡 。
3. 峰型異常問題
峰型問題是液相的主要問題，在做液相過程中，我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型，對于各種各樣的異常峰，要區(qū)別對待，從主要問題出發(fā)，逐個(gè)加以解決。針對各種情況的成因作相應(yīng)調(diào)整即可。 （1）色譜圖中未出峰。原因：系統(tǒng)未進(jìn)樣或樣品分解；泵未輸液或流動(dòng)相使用不正確；檢測器設(shè)置不正確。
（2）一個(gè)峰或幾個(gè)峰是負(fù)峰。原因：流動(dòng)相吸收本底高；進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣；樣品組分的吸收低于流動(dòng)相。
（3）所有峰均為負(fù)峰。原因：信號電纜接反或檢測器輸出極性設(shè)置顛倒；光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡。
（4）所有峰均為寬峰。原因：系統(tǒng)未達(dá)到平衡；溶解樣品的溶劑極性比流動(dòng)相差很多；色譜柱尺寸及類型選擇不正確；色譜柱或保護(hù)柱被污染或柱效降低；溫度變化造成的影響；流動(dòng)相組成變化；流動(dòng)相粘度過高流速太低；樣品體積過大；檢測器時(shí)間常數(shù)過大；檢測池體積過大；保留時(shí)間太長；柱外體積過大；樣品過載等。
（5）所出峰比預(yù)想的小。原因：樣品黏度過大；進(jìn)樣品故障或進(jìn)樣體積誤差；檢測器設(shè)置不正確．定量環(huán)體積不正確；檢測池污染；檢測器燈出現(xiàn)問題。
（6）出現(xiàn)雙峰或肩峰。原因：進(jìn)樣量過大；樣品濃度過高；保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞；保護(hù)拄或色譜柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
（7）前伸峰。原因：進(jìn)樣量或樣品濃度高；溶解樣品的溶劑較流動(dòng)相極性強(qiáng)；保護(hù)柱或色譜柱污染或失效。
（8）拖尾峰。原因及解決辦法：柱超載，降低樣品量或增加柱直徑采用較高容量的固定相；峰干擾，對樣品進(jìn)行清潔過濾或調(diào)整流動(dòng)相；硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度，降低流動(dòng)相pH值；柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼，加在線過濾器，對樣品進(jìn)行過濾；死體積或柱外體積過大，將連接點(diǎn)降至最低, 盡可能使用內(nèi)徑較細(xì)的連接管；柱效下降，更換柱子, 采用保護(hù)柱，對柱子進(jìn)行再生。
（9）出現(xiàn)平頭峰。原因：檢測器設(shè)置不正確；進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高。
（10）出現(xiàn)鬼峰。原因及解決辦法：進(jìn)樣閥殘余峰，在每次進(jìn)完樣后用充足的時(shí)間來平衡和清洗系統(tǒng)；樣品中存在未知物，改進(jìn)樣品的預(yù)處理；流動(dòng)相污染，更換新流動(dòng)相，盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，隔夜的流動(dòng)相再次使用時(shí)要過濾；盡可能使用HPLC級試劑；流路中有小的氣泡，打開Purge閥，加大流速排除。
另外，還有一些用戶的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下：
色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外，在做柱性能測試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。
1、樣品的前處理：
– 最好使用流動(dòng)相溶解樣品。
– 使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
– 使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制： 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
– 流動(dòng)相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。 – 流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
– 流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時(shí)能得到好的分離效果;同時(shí)降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
– 流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
– 流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
– 在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動(dòng)相流速的選擇： 因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。 當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
