分享一篇發(fā)表在ACS Chem. Biol.上的文章，題目為“Chemoproteomic Profiling of Clickable Fumarate Probes for Target Identification and Mechanism of Action Studies”，通訊作者是來自美國Biogen公司的Douglas S. Johnson和Lu Zhang。這篇文章中作者設(shè)計了一種可點擊探針用于富馬酸酯的靶標(biāo)鑒定和作用機制研究。
富馬酸二甲酯（DMF）是針對多發(fā)性硬化癥的一種成熟口服療法，然而DMF具有廣譜的體內(nèi)反應(yīng)性和復(fù)雜的藥代動力學(xué)，其作用機制仍不清楚。DMF在生理條件下容易水解產(chǎn)生富馬酸單甲酯（MMF），這兩種富馬酸酯會在蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基上形成共價修飾，發(fā)揮調(diào)控功能。因此對DMF和MMF進行蛋白質(zhì)組水平的靶標(biāo)鑒定有助于明確DMF的治療機制。
于是作者在DMF和MMF的結(jié)構(gòu)中引入生物正交的炔基基團，合成了兩種富馬酸酯的可點擊類似物探針DMF-yne和MMF-yne。使用探針對活細(xì)胞或細(xì)胞裂解液進行標(biāo)記后，通過膠內(nèi)熒光觀察探針標(biāo)記的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示兩種探針都可以濃度依賴地標(biāo)記蛋白質(zhì)，并且這種標(biāo)記可以被各自的母體化合物DMF和MMF所競爭。作者進一步將探針標(biāo)記的蛋白與生物素偶聯(lián)后使用鏈霉親和素進行富集，利用Western Blot驗證了探針可以對富馬酸酯的已知靶標(biāo)KEAP1進行共價修飾。
在驗證了探針與母體化合物富馬酸酯具有相似的反應(yīng)性后，作者采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對富馬酸酯靶標(biāo)進行全面分析。利用TMT-16plex，作者整合了探針濃度梯度和母體化合物競爭濃度梯度實驗，獲得了DMF_yne和MMF_yne探針特異性標(biāo)記的定量靶標(biāo)譜圖。隨后，作者通過Western Blot對質(zhì)譜結(jié)果中兩種探針的的共同靶標(biāo)如GAPDH和DJ-1，以及兩種探針的獨特靶標(biāo)如ALDH2和VDAC3等蛋白與探針的共價反應(yīng)進行了驗證。
最后，作者利用基于碘乙酰胺-脫硫生物素探針的TMT-ABPP實驗，對細(xì)胞中DMF和MMF的半胱氨酸反應(yīng)性進行了分析，鑒定富馬酸酯敏感的半胱氨酸位點。將結(jié)果與基于富馬酸酯探針的定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進行比較，作者發(fā)現(xiàn)兩種方法都能鑒定到很多獨特的靶標(biāo)，說明其開發(fā)的富馬酸酯探針可以作為鑒定富馬酸酯敏感靶標(biāo)的很好的補充方法。
?
總之，這篇文章中作者設(shè)計了一種可點擊的富馬酸酯探針，用于鑒定富馬酸酯藥物的共價修飾靶標(biāo)。
本文作者：LCX
責(zé)任編輯：LZ
DOI：10.1021/acschembio.4c00617
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acschembio.4c00617
