分享一篇發表在Analytical Chemistry上的文章，本文的標題為“Near-Infrared Bioluminescence Assays for Protein?Protein Interactions and Cellular Membrane Fusion in Deep Tissues Using Split Akaluc Reconstitution”，本文的通訊作者為東京大學的Takeaki Ozawa教授，課題組的研究方向為生物分子成像和蛋白質互作分析方法的開發。
基于熒光素酶催化熒光素的生物發光成像在活體中具有獨特的優勢，其無需外部激發，能夠實現高信噪比的實時監測。然而，現有生物發光系統（如螢火蟲熒光素酶 Fluc和NanoLuc）在深層組織成像方面存在局限性，如信號穿透力低、背景噪聲高等。為此，本文報道了一種基于近紅外發光酶Akaluc的酶裂片互補技術，通過計算機模擬和實驗篩選確定了最佳拆分位點，分別融合感興趣的蛋白，當蛋白在發生相互作用發生時恢復熒光素酶的催化發光能力，從而提高信號靈敏度和組織穿透能力。
首先，為了明確Akaluc最佳的切割位點，作者依據Fluc的結構設計構建了一個Akaluc片段文庫，并使用雷帕霉素誘導FK506 結合蛋白（FKBP）和FKBP結合域（FRB）相互作用，根據發光強度和結合前后發光相對變化幅度進行了篩選，最終選擇了N410/C392作為最佳切割位點。
隨后，作者在體外和體內分別驗證了該策略對GPCR/β-Arrestin 互作的可行性。體外實驗選取FPR1-β-Arrestin 1和ADRB2-β-Arrestin 2作為模型，以評估Akaluc系統對 GPCR/β-Arrestin 相互作用時間模式的檢測能力。作者將AkalucN 與 β-Arrestin融合，AkalucC與GPCRs融合，并在GPCR與AkalucC之間引入柔性短肽 (GGGGS)4以恢復其立體結構。cAMP水平和發光強度變化顯示，配體誘導的GPCR/β-Arrestin互作使兩段Akaluc片段接近并恢復生物發光活性。同時作者還檢測了Akaluc系統的靈敏度，并發現在HEK293細胞中，1 nM配體濃度就能誘導明顯的發光信號。此外作者還捕捉到不同GPCR/β-Arrestin結合模式的時序差異，展現了其在GPCR信號研究中的應用潛力。
在體內實驗中，作者比較Akaluc和Fluc系統，發現GPCR/β-arrestin 交互作用僅能導致Akaluc裂片的互補并發出能夠穿透深層組織的近紅外光。通過同時注射競爭性抑制劑prop和配體iso，發光強度被顯著抑制，說明生物發光信號的特異性。
由于Akaluc片段表現出高效的重構特異性，作者分別開發了兩種包含Akaluc片段的細胞系，利用Akaluc系統檢測肌細胞融合過程。通過將分別表達AkalucN和AkalucC片段（分別稱為N探針和C探針）的細胞系引入小鼠C2C12肌細胞中，當肌細胞發生融合時，N探針和C探針自發相互作用，并通過蛋白質剪切反應共價重構為功能性Akaluc，從而產生生物發光。最后，作者將Akaluc系統應用至活體小鼠中，并成功觀測到與體外實驗一致的肌細胞融合事件。
?最后，作者將Akaluc系統應用至活體小鼠中，并成功觀測到與體外實驗一致的肌細胞融合事件。
總的來說，本文開發了一種Akaluc裂片重構方法，并驗證其作為檢測深層組織細胞事件的有效工具。
本文作者：CJJ
責任編輯：WYQ
DOI：10.1021/acs.analchem.4c06986
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06986
