分享一篇發表在Journal of American Chemical Society上的文章，題目為“An mRNA Display Approach for Covalent Targeting of a Staphylococcus aureus Virulence Factor”，通訊作者有三位，分別是來自基因泰克公司多肽治療研究部門的Alix I Chan和Christian N. Cunningham，以及來自斯坦福大學的Matthew Bogyo教授，他的工作圍繞水解酶的功能和探針開發展開。
共價抑制劑類藥物可以與靶蛋白的親電結構形成共價鍵，其更強的相互作用可以提升藥物的療效、特異性，并降低耐藥性。共價抑制劑的理性設計通常依賴于靶蛋白的結構信息，在缺乏蛋白質結構信息的情況下，共價抑制劑的從頭設計通常采用高通量篩選的方法，例如使用遺傳編碼的文庫進行抑制劑篩選，其中就包括mRNA展示技術，這種技術能在肽或蛋白質翻譯的過程中或翻譯后摻入共價彈頭，并可以通過靈活的體外翻譯（the Flexible In vitro Translation，FIT）系統，將多種非天然氨基酸摻入肽庫中。
作者團隊于2018年使用FP（fluorophosphonate）探針和基于活性的蛋白質組分析 （ABPP）發現了金黃色葡萄球菌中的一個新型絲氨酸水解酶家族，FphB是其中一員，它是一種膜蛋白，對于宿主內特定組織的有效細菌定植很重要。因此，在這篇文章中，作者使用了一種含有惡二唑酮共價彈頭的非天然氨基酸OxF來進行金黃色葡萄球菌絲氨酸水解酶FphB的共價環肽探針的篩選。
作者首先設計了一種基于惡二唑酮的彈頭片段JJ-OX-009，并將其連接到含有酮修飾的非天然氨基酸中構筑非天然氨基酸OxF-CME，隨后通過酰化修飾的方式與tRNA偶聯。作者通過NanoBiT發光測定法測試了其體外翻譯的效率，大約是苯丙氨酸的50%左右。
接下來，作者使用了基因重編程體外翻譯（IVT）系統和mRNA展示方法。作者首先生成了由6-10個氨基酸組成的大環肽的文庫并進行體外翻譯和篩選，每個肽由一個N-氯乙酰化氨基酸引發，該氨基酸與下游半胱氨酸巰基反應形成環化，每種肽都含有一個惡二唑酮彈頭，彈頭在大環中的位置并不相同。作者利用FphB對該文庫進行了五輪定向篩選，并對富集得到的環肽序列進行了聚類分析，從中選擇了FphB-OX-14和FphB-OX-5進行后續的合成和驗證。作者通過蛋白質譜實驗和突變體實驗證明了標記是共價不可逆的，并且是活性依賴性和位點特異性的。作者通過突變掃描實驗而證明了環肽對FphB的活性完全依賴于序列。作者還通過AlphaFold2的建模結構進行了環肽和FphB的分子對接模擬，預測了環肽共價抑制FphB的方式。
最后，作者基于FphB-OX-14和FphB-OX-5，合成了可以在金黃色葡萄球菌中進行活細胞熒光標記的熒光探針，進行了活菌的熒光成像，以及慢性金黃色葡萄球菌感染小鼠模型的活體成像。
總之，作者基于重編程體外翻譯系統和mRNA展示方法，構建了含有惡二唑酮共價彈頭的環肽文庫，針對FphB進行了共價環肽抑制劑的篩選。
本文作者：ZCL
責任編輯：LZ
DOI：10.1021/jacs.4c15713
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c15713
