分享的是一篇近期發(fā)表在期刊 JACS 上的文章。文章標題是“Sialylation Shields Glycoproteins from Oxidative Stress: Mechanistic Insights into Sialic Acid Oxidation and Structural Stability”，本文的通訊作者是來自南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院的李功玉特聘研究員（研究方向：D-蛋白質(zhì)譜分析）和付浩浩副研究（研究方向：分子模擬增強采樣算法和自由能計算）。
在本文中，作者通過一種微尺度低溫等離子體（microLTP）裝置，模擬了細胞中復(fù)雜的氧化應(yīng)激環(huán)境，并結(jié)合高分辨率質(zhì)譜分析（MS）和密度泛函理論（DFT）計算，首次完整繪制了兩種常見唾液酸（Neu5Ac 和 Neu5Gc）在自由基氧化條件下的氧化路徑圖。并進一步使用人轉(zhuǎn)鐵蛋白（hTF）作為模型，根據(jù)一系列 LC-MS/MS ?位點定位、唾液酸化特異性酶處理和 AIU-IM-MS 技術(shù)，確定了特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基序和唾液酸化模式。（Scheme 1）
microLTP 衍生的 ROS 的表征
優(yōu)化研究表明，microLTP 處理時間和外部高壓功率幅度會顯著影響 ROS 的產(chǎn)生。在相同條件下，ROS 豐度順序為：H?O? > O?? > 1O? > ?OH。通過調(diào)控 microLTP 參數(shù)可生成特定濃度范圍的 ROS，為后續(xù)實驗確定了 ROS 生成的最佳條件。
唾液酸的深度自由基氧化
為了探究反應(yīng)機理，作者計算了反應(yīng)中間體的自由能（圖?1d-f），結(jié)果表明與不同量的 O? 反應(yīng)時，會產(chǎn)生不同的穩(wěn)定異構(gòu)體產(chǎn)物和反應(yīng)路徑。Neu5Ac 與 Neu5Gc 的羥基差異如圖?1g?所示，作者進一步測量了 Neu5Ac 與 Neu5Gc 的氧化動力學(xué)曲線，發(fā)現(xiàn) Neu5Gc 因多一個羥基而表現(xiàn)出更強的抗氧化能力。
如?Scheme 2?所示，作者通過 microLTP 生成了 Neu5Ac 氧化的 46 種中間體和產(chǎn)物，包括側(cè)鏈氧化（步驟 I–III）和環(huán)斷裂（步驟 IV）的逐步路徑，并通過 DFT 計算和質(zhì)譜驗證了各步驟的異構(gòu)體及熱力學(xué)穩(wěn)定性。
hTF 的唾液酸化依賴性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性
傳統(tǒng) CIU 為 hTF 產(chǎn)生了不同的電荷態(tài)依賴性去折疊模式，當將數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)換為 AIU 模式（圖?2g）時，可以直接明確地比較具有不同處理的 6 個 hTF 樣本的去折疊行為。通過比較氧化后 hTF 的 CCS、AIU5 和 RMSD 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)唾液酸化顯著提升了蛋白抗氧化的能力。
唾液酸化 hTF 的自由基氧化曲線
根據(jù)酶處理后的氧化水平變化，將鑒定出的肽分為兩類：上調(diào)（I）和下調(diào)（II）。I 組肽（如 47-60、531-541等）氧化水平顯著上調(diào)，對自由基氧化反應(yīng)性更高；II 組肽（如 70-107、123-132等）氧化程度顯著降低（圖?3a）。從 hTF 的 3D 結(jié)構(gòu)來看（圖?3b、c），I 組肽大多位于 C 端且靠近糖基化位點（Asn432 和 Asn630），說明糖基化可能對抵抗主鏈氧化有保護作用；而 II 組肽氧化水平降低可能是因為去除游離寡糖后結(jié)構(gòu)重排造成的。這些結(jié)果進一步揭示了糖基化修飾和氧化作用在影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面的復(fù)雜相互作用。
圖?3. 受唾液酸化和?N-糖基化調(diào)節(jié)的 hTF 的自由基氧化曲線
隨后，作者還全面表征了在不同血漿處理時間下在 Asn432 和 Asn630 位點的糖型變化（圖?4c、d），發(fā)現(xiàn)有唾液酸化的糖在 Asn432 和 ?Asn630 位點隨時間增加而減少，且不同數(shù)量的唾液酸化糖型比例進一步證明了唾液酸化糖的氧化降解。
?綜上所述，本研究首次揭示了唾液酸化修飾在保護蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能免受氧化應(yīng)激損傷中的分子機制。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解糖基化在細胞應(yīng)激中的作用提供了新的視角，還為開發(fā)更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物開辟了潛在的創(chuàng)新方向。
原文鏈接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c14454
