Gao等人于2007年首次報(bào)道Fe3O4納米顆?？梢阅M辣根過氧化物酶(HRP)并根據(jù)米氏(Michaelis-Menten)參數(shù)發(fā)現(xiàn)Fe3O4可以提供更好的活性(Nat. Nanotechnol.?2007,?2, 577?583)。此后，各種納米粒子作為過氧化物模擬酶被廣泛地應(yīng)用于許多重要領(lǐng)域。鑒于沒有統(tǒng)一的衡量標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)判這些過氧化物納米酶的性能，Jiang等人定義了過氧化物納米酶的催化常數(shù)(kcat)為“kcat_P?=?Vmax/[P]”（[P]是納米酶顆粒的摩爾濃度，Vmax指最大反應(yīng)速率），使用該衡量指標(biāo)，可以得出Fe3O4比HRP活性更高(Nat. Protoc.?2018,?13, 1506?1520)。有趣的是，Ji等人最近實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Fe3O4的過氧化物模擬酶活性相比于HRP幾乎可以忽略不計(jì)(Nat. Catal.?2021,?4, 407?417)；Gumpelmayer等人也認(rèn)為Fe3O4沒有過氧化物模擬酶活性(Angew. Chem., Int. Ed.?2018,?130, 14974?14979)，這些發(fā)現(xiàn)和過去十年的研究結(jié)論明顯相悖。鑒于Fe3O4是此領(lǐng)域最具有代表性的納米酶之一，解決上述研究分歧對(duì)于未來過氧化物模擬酶的設(shè)計(jì)意義重大。
近日，香港城市大學(xué)彭詠康課題組從原子視角分析了這個(gè)爭(zhēng)議，并提出了解決方案。通過追溯HRP的工作原理以及kcat的定義，發(fā)現(xiàn)這些分歧的起因是kcat公式中對(duì)于分母—酶濃度的表示方式各不相同。在生物酶領(lǐng)域中，kcat指單個(gè)活性位點(diǎn)單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物分子數(shù)，比如具有單個(gè)鐵卟啉活性單元的HRP分子，一摩爾的HRP含有一摩爾的鐵卟啉，其kcat等于Vmax除以HRP的摩爾濃度。后來這個(gè)計(jì)算方式也被廣泛地應(yīng)用在過氧化物納米酶的研究中。但是，與HRP不同的是納米酶活性位點(diǎn)數(shù)量不僅僅與[P]相關(guān)，因此直接應(yīng)用此公式會(huì)得到一些錯(cuò)誤的結(jié)論。具體而言，對(duì)于給定的納米酶，Vmax不僅與[P]相關(guān)，也與每個(gè)顆粒的表面積(SNP)、單位表面積的位點(diǎn)的密度(A)有關(guān)。以300 nm的Fe3O4為例，kcat_Fe?=?Vmax?/[Fe]，[Fe]=[P]×SNP×A，每個(gè)300 nm Fe3O4表面大約3.7×106個(gè)鐵原子活性位點(diǎn)，而每個(gè)HRP只有一個(gè)鐵卟啉活性位點(diǎn)，因此一個(gè)Fe3O4顆粒具有的活性位點(diǎn)數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于一個(gè)HRP所具有的。這也就解釋了為什么只考慮kcat_P?=?Vmax/[P]計(jì)算時(shí)，F(xiàn)e3O4的活性可以高于HRP。有鑒于此，作者建議公式中的[P]應(yīng)包含所有顆粒表面活性原子的濃度來公平合理地對(duì)比納米酶的活性。
此外，該工作根據(jù)?kcat_Fe重新比較了文獻(xiàn)中不同尺寸的Fe3O4活性，有趣的是：如示意圖2所示，大顆粒Fe3O4的kcat_Fe比小顆粒Fe3O4高兩個(gè)數(shù)量級(jí)左右，這一現(xiàn)象和普遍的認(rèn)知（納米催化劑粒徑越小活性越高）相反。作者認(rèn)為這一反差起因于大顆粒Fe3O4的多晶性質(zhì)，有一些高活性的Fe原子存在于多晶 Fe3O4的表面晶界處。為進(jìn)一步證明這一觀點(diǎn)，作者制備了多晶Fe3O4（p-Fe3O4）與商業(yè)化單晶Fe3O4（s-Fe3O4）進(jìn)行對(duì)比和探討。作者使用TEM, SEM, XRD等技術(shù)表征s-Fe3O4和p-Fe3O4的形貌，尺度，結(jié)構(gòu)等，通過材料對(duì)特征底物TMB催化氧化前后的吸光度變化來進(jìn)行性能的測(cè)試和比較，通過米氏方程研究s-Fe3O4和p-Fe3O4催化的動(dòng)力學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)兩種材料的kcat_Fe存在大約兩個(gè)數(shù)量級(jí)的差異?；诒菊n題組之前對(duì)過渡金屬氧化物作為過氧化物酶的機(jī)理研究(ACS Appl. Mater. Interfaces?2022,?14, 22728?22736)：表面低價(jià)態(tài)活性金屬原子與H2O2的氧化還原反應(yīng)是決定酶促活性的關(guān)鍵。對(duì)Fe3O4而言，表面Fe(II)的數(shù)量決定了所產(chǎn)生的OH自由基和被氧化TMB的多寡，因此表面Fe(II)的含量與所獲得的Vmax正相關(guān)。相比之下表面Fe(III)與H2O2的氧化還原低了至少三個(gè)數(shù)量級(jí)，不僅對(duì)酶促反應(yīng)的Vmax沒有幫助，反而在kcat_Fe的分母[Fe]中有一定的占比。根據(jù)上述機(jī)理，作者提出s-Fe3O4和p-Fe3O4的活性差異是由于這兩種材料表面活性Fe(II)和惰性Fe(III)的不同所導(dǎo)致的。作者接下來使用XPS,TPO等測(cè)試驗(yàn)證了這一猜想，得出了s-Fe3O4和p-Fe3O4表面Fe的分布情況和化學(xué)狀態(tài)確實(shí)非常不同，即p-Fe3O4具有更高的Fe(II)/Fe(III)比例，并且其表面晶界處的Fe(II)具有更高的反應(yīng)活性。本工作從原子水平的角度闡述了當(dāng)前研究過氧化物模擬酶活性存在矛盾的根本原因，提供了一個(gè)更加合理的評(píng)價(jià)過氧化物酶活性的方法，對(duì)設(shè)計(jì)高效過氧化物模擬酶有指導(dǎo)性意義。
示意圖1.?(a,b)HRP酶由Fe(III)-卟啉和兩個(gè)氨基酸(His-42, Arg-38)共同激活H2O2并通過氧化AH2(兩電子供體)來完成催化循環(huán)，(c,d)其他文獻(xiàn)和該工作中提出的過氧化物模擬酶反應(yīng)機(jī)理。
圖2.?文獻(xiàn)及本工作中獲得的HRP和Fe3O4的Michaelis-Menten參數(shù)比較。
圖3.?s-Fe3O4和p-Fe3O4的結(jié)構(gòu)表征。
圖4.?s-Fe3O4和p-Fe3O4作為過氧化物納米酶的活性差異研究。
圖5.?(a-d) s-Fe3O4和p-Fe3O4活性差異的動(dòng)力學(xué)研究, 表面Fe(II)/Fe(III)比例和Fe(II)活性研究，(e)不同尺寸p-Fe3O4的kcat_P和kcat_Fe比較。
論文信息：
An Atomic Insight into the Confusion on the Activity of Fe3O4?Nanoparticles as Peroxidase Mimetics and Their Comparison with Horseradish Peroxidase.
Yuwei Qiu, Bo Yuan,?Hua Mi,?Jung-Hoon Lee, Shang-Wei Chou?and Yung-Kang Peng.
J. Phys. Chem. Lett. 2022, 13, 8872?8878. https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.2c02331
