分享一篇發表在Nature上的文章，題目為“Engineering a genomically recoded organism with one stop codon”，通訊作者共兩位，分別是來自耶魯大學的Farren J. Isaacs教授和Jesse Rinehart教授。Rinehart課題組主要從事磷酸化修飾方向的研究，Isaacs課題組的研究方向為細胞工程與定向進化。
在天然系統中，基因翻譯依賴三聯密碼子決定蛋白質的氨基酸序列，其中TAG、TGA和TAA是標準的終止信號。這些終止密碼子雖然功能相同，但它們的并存僅僅是進化冗余的產物。在本文中，研究人員通過合成生物學手段，將所有終止密碼子壓縮至UAA，釋放了UAG和UGA的氨基酸編碼能力，從而將其用于高效整合非標準氨基酸（non-standard amino acids）。
為了實現這一目標，研究人員采用了多重自動基因組工程（MAGE）技術，這是一種基于寡核苷酸定向突變的精確基因編輯方法。通過設計一系列短寡核苷酸，攜帶TGA→TAA的突變信息，并將其導入大腸桿菌C321.ΔA菌株，利用宿主的錯配修復系統進行同源重組，逐步完成TGA的替換。這一過程被循環多次，最終完成了1195個TGA密碼子的全基因組替換。
在解決了TGA密碼子的替換問題后，研究人員還面臨釋放因子2（RF2）的挑戰。RF2能夠識別UGA并終止翻譯，這可能會干擾UGA作為密碼子的重新編碼。為了解決這一問題，研究團隊對RF2進行了精準工程化改造，引入了S205P和E170K突變，顯著降低了RF2對UGA的親和力，從而為UGA的重新編碼創造了條件。
此外，研究人員還發現天然大腸桿菌的tRNATRP具有一定的搖擺效應，能夠錯誤地識別UGA并在UGA密碼子位置插入色氨酸。為了解決這一問題，研究人員在tRNATRP上引入了A37G突變，破壞了i6A37修飾，使tRNATRP不再錯誤識別UGA，從而確保了UGA可以作為一個真正獨立的密碼子用于非標準氨基酸的整合。
在解決了密碼子誤讀和釋放因子干擾的問題后，研究團隊構建了一套正交翻譯系統，為UAG和UGA分別設計了特定的氨酰-tRNA合成酶，UAG重新編碼為對乙酰苯丙氨酸（pAcF），UGA重新編碼為Boc-賴氨酸（BocK）。經過優化的菌株在UAG+UGA雙非標準氨基酸整合方面的效率提高了20倍，蛋白的翻譯準確率達到99%以上。
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這一研究成果不僅推動了對遺傳密碼可塑性的理解，也為生物制造和合成生物學開辟了新的可能性。新型菌株展現出卓越的生物安全性，由于不再使用TAG和TGA作為終止密碼子，病毒無法通過常規的翻譯機制劫持宿主細胞來復制自身。噬菌體感染實驗驗證了這一點，新型菌株對含TAG的λ噬菌體完全抵抗，并顯著降低了含TGA的μ噬菌體感染率。
本文作者：TZS
責任編輯：WYQ
DOI：10.1038/s41586-024-08501-x
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08501-x
