分享一篇發表在RSC Chemical Biology上的文章，題目為“Functionalization of a versatile fluorescent sensor for detecting protease activity and temporally gated opioid sensing”，通訊作者是來自密歇根大學安娜堡分校的Wenjing Wang教授，研究方向是基于蛋白質的新型傳感器。
遺傳編碼的熒光傳感器被廣泛應用于檢測細胞信號分子和事件。這些傳感器具有不同的信號讀出方式，用于檢測GPCR等受體或蛋白酶的活性，可被分為多組分系統和單組分系統。在單組分系統中，SPOTIT（Single-chain Protein-based Opioid Transmission Indicator Tool）系列具有多功能性和巨大的功能潛力，然而其對于蛋白酶的響應還尚未實現功能化，并且缺少時間門控的控制方式。因此，在本文中作者以cpGFP-Nb39為基礎發展了一種新型的熒光傳感器 MAturation-based Protease-gated Indicator Tool (MAPIT)，用于檢測病毒蛋白酶，并實現了基于小分子的時間門控。
MAPIT包含兩個Nb39 nanobody，當阿片類藥物存在時，一個Nb39會與受體MOR相互作用，然而另一個Nb39仍與cpGFP結合抑制其發光。當蛋白酶切割事件發生時一個Nb39離去，與cpGFP結合的Nb39結合MOR會釋放出GFP從而產生熒光。
首先，由于增加linker的長度可以增加對蛋白酶的通用性，但linker的長度可能影響 Nb39 和 cpGFP 之間的相互作用。因此，作者在單組分系統中優化了linker的長度。他們發現在兩側各15個氨基酸的情況下仍然能夠保持28的信噪比（SBR），并且在未切割的條件下不會影響對cpGFP發光的抑制。隨后作者針對新冠病毒的蛋白酶Mpro優化了酶切位點的序列，其中VARLQ↓SGF 顯示出最佳的 Mpro 依賴性熒光激活。
?隨后，作者又進一步在細胞體系下檢測了MAPIT的特異性，他們發現只有當表達?Mpro時熒光才會被激活，而當表達TEVp或HCVp時均不會被激活，表明傳感器對蛋白酶底物的特異性。最后，作者進一步引入了Tet-On系統，建立了Dox激活的Dox-MAPIT傳感器。作者在Dox?存在下對?Dox-MAPIT?進行了芬太尼劑量反應曲線，觀察到EC50為50 nM，比此前開發的時間門控SPOTIT系統有較大的靈敏度提升。
總的來說，作者開發了一種多功能熒光傳感器，用于檢測蛋白酶活性和時間門控的阿片類物質感知。
本文作者：WYQ
責任編輯：MB
DOI：10.1039/d4cb00276h
原文鏈接：https://doi.org/10.1039/d4cb00276h
